肠道菌群与动物肠黏膜免疫调控
肠道是动物机体与外界环境接触最为密切的组织之一，也是机体最大的免疫器官。肠黏膜中分布着机体50%以上的淋巴组织，而肠道中共生着大量结构复杂的菌群。近年来，在肠道菌群对动物的营养调控作用受到人们关注的同时，肠道菌群调控下的肠黏膜系统对动物的免疫与健康作用也日益引起研究者的高度重视。肠道正常菌群和肠黏膜结合形成的机械屏障、免疫屏障与生物屏障不仅发挥着保持机体内环境稳定的作用，而且能有效防止致病物质的入侵和菌群内毒素的位移。同时，肠道菌群通过一系列生理作用对肠黏膜免疫功能进行动态调控。
肠道菌群情况
2、肠黏膜免疫细胞的功能
1、动物肠道菌群的定植与特性
动物肠道菌群在肠道发育完成后保持相对稳定的状态，那么肠道菌群在动物肠道中是如何定植的呢？动物肠道中的菌群是一个独特、多样的生态系统，也是已发现的生态系统中细胞密度较高的系统之一。该系统中栖息着大约30属的500多种菌群，主要由专性厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌组成，其中专性厌氧菌占99%以上，仅类杆菌和双歧杆菌就占细菌总数的90%以上。动物肠道原籍菌群主要来源于母体，在消化道内的定植顺序首先是需氧菌，然后是兼性厌氧菌，最后才是专性厌氧菌。这些肠道菌群在动物出生后最初的种类和数量极少，新生动物从富含母体菌群的环境中获得肠道菌系，并且随着外源菌的不断侵入，在肠道内迅速形成一个庞大的菌群。定植后的菌群生活在3个完全不同的微生态环境中，即有的生活在腔道内，有的生活在肠上皮细胞（iEC）表面，有的生活在肠黏膜隐窝内。其中定植于肠上皮细胞表面和肠黏膜隐窝内的菌群多数是原籍菌群，其深层主要寄居着厌氧菌，中层为类杆菌、消化链球菌，表层为大肠杆菌、肠球菌等，它们都与宿主的肠黏膜免疫细胞有着极为密切的关系。研究发现，给刚出生的无菌小猪接种非致病性大肠杆菌，在最初几天即可观察到肠黏膜通透性增加、一些菌群移位到肠系膜淋巴结、产生特异性抗菌抗体以及多克隆的B细胞被激活等生理现象。肠道菌群情况
2、肠黏膜免疫细胞的功能
肠道不仅是营养物质消化吸收的场所，还是机体内最大的菌群和毒素贮存库。正常肠道之所以能将数量巨大的细菌和毒素等有害物质有效地局限于肠道内，是因为肠道黏膜免疫系统通过诱导部位和效应部位的细胞共同发挥着生理效应，产生多方面、多层次的免疫防护功能。
2.1诱导部位细胞的功能
肠道菌群能促进和诱导部位细胞发挥其免疫功能。肠上皮细胞和派氏集合淋巴结（PP）淋巴细胞是肠黏膜免疫的主要诱导部位细胞。肠上皮细胞除具有消化吸收功能外，还具有摄取和释放分泌型免疫球蛋白A（SIgA）、提呈抗原和分泌细胞因子等免疫功能。近年的研究发现，肠上皮细胞对口服耐受（OT）也具有重要的调控作用，当肠上皮细胞来源的转化生长因子-α（TGF-α）被激活后，可抑制白细胞介素-4（IL-4）的反应，从而抑制局部肠腔抗原的超敏反应。这是因为IL-4可以诱导B细胞转化为分泌型免疫球蛋白E（SIgE），同时还可以促进肥大细胞的生长。此外，研究者对肠上皮细胞的超微结构也做了深入研究。Cerutti等研究发现，肠道单层上皮的通透性主要取决于具有连接紧密、有效封闭的顶端肠上皮细胞的能力，而肠上皮细胞的间隙恰被一种叫做内嵌蛋白的物质所占据，此蛋白能结合到紧密连接蛋白-1（ZO-1）上，ZO-1能将其连接到网状的细胞骨架上。PP是由众多B细胞组成的小肠黏膜淋巴滤泡组织，而B细胞是构成SIgA和少量免疫球蛋白E（IgE）的前体细胞，PP作为肠道特异性免疫反应的主要场所，不但在肠黏膜屏障保护功能中发挥着重要作用，同时对肠道菌群平衡具有调节作用。
2.2效应部位细胞的功能
肠道菌群能促进和诱导效应部位细胞发挥其免疫功能。肠黏膜免疫的效应部位细胞主要包括肠上皮内淋巴细胞（iIEL）、固有层淋巴细胞（LPL）和一些相关的外分泌腺细胞。肠上皮内淋巴细胞是动物体内最大的淋巴细胞群，在肠道免疫系统中发挥着主力军的作用。但其具体生理功能目前尚不十分清楚，推测肠上皮内淋巴细胞的功能代表一种原始的免疫防御机制，主要功能是识别来自病原体的非多肽性抗原和肠道组织损坏的细胞产物。Camerini等将外周淋巴结的淋巴细胞移植到重症联合免疫缺陷（SCLD）小鼠上进行试验，观察其小肠时发现，来源于胸腺的成熟T细胞可移行到小肠，并在小肠环境中分化为有特殊功能的肠上皮内淋巴细胞，但SCLD受体鼠的肠道菌群数量很少，肠上皮内淋巴细胞数量也很少。据此推测，肠上皮内淋巴细胞可能与位于固有层的肠道菌群抗原有关。另外一种效应部位细胞固有层淋巴细胞弥散地分布于肠道黏膜的固有层内，主要为CD4+T细胞和SIgA。其中CD4+T细胞能分泌白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β）等下调免疫反应的细胞因子，同时可影响SIgA+B细胞对SIgA的分泌而SIgA+B细胞则主要通过SIgA发挥免疫效应，能够和病原菌、毒素及抗原性物质发生特异性结合，从而阻止肠道有害菌的入侵和抗原性物质渗透过肠黏膜屏障。
3、肠道菌群对肠黏膜屏障功能的调控作用
肠道菌群可以对肠粘膜屏障功能进行调控，使得肠粘膜菌膜层达到稳态平衡。肠黏膜屏障包括机械屏障、免疫屏障与生物屏障，其中机械屏障由肠上皮细胞、细胞间紧密连接蛋白（ZO）与菌膜三者构成免疫屏障由免疫球蛋白与免疫活性细胞、细胞因子等共同组成生物屏障由肠道菌群和肠上皮细胞结合产生的黏蛋白、活性肽等共同组成。
肠黏膜屏障
3.1对机械屏障的调控作用
人们在研究中逐步发现，肠道菌群对肠黏膜机械屏障的调控具有多种途径。第1种途径是肠道正常菌群通过肠上皮细胞间ZO进行调控。其中，ZO-1与紧密连接蛋白-2（ZO-2）是肠黏膜机械屏障的重要组成部分。肠道中的大肠杆菌可以通过上调ZO-1的表达，减轻肠上皮的通透性同时通过上调ZO-2的表达，保护与修复由肠上皮细胞形成的机械屏障。Lind等在乳糜泻患者治疗的研究中发现，双歧杆菌可以有效减少由小麦醇溶蛋白引起的结肠上皮细胞的细胞膜皱折，并通过对ZO-1表达情况的检测，证实了其对结肠上皮细胞间紧密连接的修复作用。第2种途径是有益菌对病原菌的定植产生阻抗作用。肠道黏液层中的糖蛋白可与病原菌竞争肠上皮细胞中的黏附素受体，从而抑制病原菌在肠道内的黏附、定植。有试验表明，乳酸杆菌Bar13表现出了很强的定植阻抗作用，能将90%的猪霍乱沙门氏菌和68%的大肠杆菌H10407从定植部位移除。第3种途径是通过肠道菌群抑制肠上皮细胞的凋亡。研究发现，鼠李糖乳酸杆菌分泌的p75和p40蛋白可激活丙氨酸氨基转移酶检测途径，从而抑制诱导肠上皮细胞凋亡的细胞因子的产生，并促进结肠上皮细胞的生长；同时肿瘤坏死因子TNF导致的结肠上皮损伤亦明显减少。
此外，肠道菌群也可通过酵解作用产生的短链脂肪酸（SCFA）间接促进肠黏膜的修复和生长。SCFA通过对肠黏膜提供能量，改善组织的局部供血，促进肠上皮细胞的修复和增加胰液中胰酶的分泌量来促进肠道的生长，这可能是肠道菌群促进肠黏膜修复和生长的主要途径。
此外，肠道菌群也可通过酵解作用产生的短链脂肪酸（SCFA）间接促进肠黏膜的修复和生长。SCFA通过对肠黏膜提供能量，改善组织的局部供血，促进肠上皮细胞的修复和增加胰液中胰酶的分泌量来促进肠道的生长，这可能是肠道菌群促进肠黏膜修复和生长的主要途径。
3.2对免疫屏障和生物屏障的调控作用
肠道正常菌群对肠黏膜免疫屏障功能的调控扮演着双重角色。一方面，作为抗原对肠黏膜存在潜在的危害；另一方面，肠内寄生菌可为肠黏膜细胞提供某些营养成分，维持肠道菌群平衡，激活肠道免疫系统。研究表明，肠道菌群对免疫屏障的调控机制可能在于肠黏膜上皮中过量的糖类物质充当着某些致病菌的特异性免疫受体同时，一些乳糖的存在能促进乳酸杆菌的大量增殖，并显著减少和抑制沙门氏菌在肠上皮细胞的定植。
肠道正常菌群同时能够对生物屏障产生保护作用。一些菌群和肠道黏膜上皮细胞结合产生的黏蛋白具有非特异性或先天防御功能，黏蛋白可在肠上皮表面形成黏液层并捕获病原菌，以防止其与肠上皮表面接触。研究发现，黏液层中的糖蛋白本身的结构和带有负电荷的特性有利于包裹细菌黏液糖蛋白暴露的化学基团与肠上皮表面结构相似，易于细菌的识别和黏附。研究发现，一些共生菌可以调控某些对肠黏膜屏障功能起重要作用的基因的表达，包括肠道上皮细胞的成熟与分化、营养物质的吸收、肠黏膜屏障结构的形成及异化合成代谢等基因的表达，但其基因表达机制尚不完全清楚。
肠道正常菌群同时能够对生物屏障产生保护作用。一些菌群和肠道黏膜上皮细胞结合产生的黏蛋白具有非特异性或先天防御功能，黏蛋白可在肠上皮表面形成黏液层并捕获病原菌，以防止其与肠上皮表面接触。研究发现，黏液层中的糖蛋白本身的结构和带有负电荷的特性有利于包裹细菌黏液糖蛋白暴露的化学基团与肠上皮表面结构相似，易于细菌的识别和黏附。研究发现，一些共生菌可以调控某些对肠黏膜屏障功能起重要作用的基因的表达，包括肠道上皮细胞的成熟与分化、营养物质的吸收、肠黏膜屏障结构的形成及异化合成代谢等基因的表达，但其基因表达机制尚不完全清楚。
4、肠道菌群对肠黏膜免疫功能的调控作用
4.1刺激特异性SIgA的产生
SIgA是肠黏膜细胞内分泌量最多的免疫球蛋白。然而SIgA的生成是在肠道抗原，特别是在菌群进入肠道后的刺激作用下逐渐增加的，肠道菌群在定植后不断向肠系膜淋巴结迁移，但迁移的细菌数量随着SIgA引起的特异性反应而减少，这些现象反映了肠道免疫屏障机制的成熟。研究发现，在一些外源有害菌或病毒引起肠道感染时，肠道内的IgA比血液中的免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）具有更大的保护作用。因此，当肠上皮细胞释放到肠腔内的SIgA和肠黏膜表面的正常菌群混合存在时，可以降低致病菌在黏膜表面的附着，中和细菌毒素并使其凝集，从而限制肠道致病菌的繁殖，以维持肠道菌群的平衡。
SIgA的合成与分泌
4.2活化肠黏膜免疫抗原提呈通路
肠道菌群能够促进T细胞的活化，提供主要组织相容性复合体（MHC），对活化肠黏膜免疫抗原提呈通路起着关键性的作用。树突状细胞（DCs）是PP圆顶区（SED）产生的目前已知的最强有力的一种抗原提呈细胞（APC），也是肠黏膜免疫中特殊的专职抗原提呈细胞。正常情况下，DCs处于休眠的未成熟状态，具有很强的细胞吞噬能力，能够高表达可捕获抗原的MHC，低表达能与辅助性T细胞（Th）受体结合产生协同作用的协同刺激分子（CM）一旦被外源菌活化，DCs便开始成熟，此时失去吞噬能力，但同时激活抗原加工机制，细胞表面开始呈现能够捕获抗原的MHC，然后在MHC刺激下肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-β（IL-β）和白细胞介素-12（IL-12）等细胞因子开始合成。此后，有益菌群如乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌根据菌量的变化，通过表层蛋白与DCs的结合来调节肠道黏膜免疫功能，其主要机制为有益菌群及其表面复合物与DCs间相互作用产生的两者间浓度比例的高低变化，使抗炎细胞因子表达发生由高到低的变化，促炎细胞因子发生由低到高的反向变化。
综合以上分析表明，非淋巴外周组织中的DCs（iDCs）是引起肠黏膜免疫反应与耐受的基础，其关键机制是：iDCs表面只表达MHC，抑制了能与Th协同作用产生具有活化T细胞第2信号的关键分子CM的表达。但值得注意的是，iDCs被激活后成熟的DCs对外源病原菌的识别仅依赖于一种高度保守的结构基序——病原相关分子模式（PAMPs），包括肠道菌群的脂多糖、肽聚糖、C-型凝集素和甘露糖受体等。
4.3激活肠黏膜免疫细胞因子与免疫应答
肠道菌群能上调TOLL样受体、IL-10等细胞因子的表达，对免疫细胞因子的调节起重要调控作用。免疫调节的主要机制是免疫系统中的免疫细胞和免疫分子之间以及与其他系统如神经内分泌系统之间的相互作用，使得免疫应答以最恰当的形式维持在最适当的水平。肠道黏膜隐窝处起始部位菌群密度升高时，可以激活隐窝内上皮细胞表面对Toll样受体TLR分子的识别，继而引发固有免疫反应应答，诱导PP细胞分泌抗菌肽，清除过量存在的外源病原菌。Ma等利用含有被极化的T84模型细胞来模拟结肠上皮细胞做体外培养试验，发现致病性沙门氏菌或TNF-α能引发一些非致病性沙门氏菌和罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuter）减弱肠黏膜细胞对白细胞介素-8（IL-8）的分泌作用。Dogi等研究发现，一些菌株能显著增加IgA+B细胞的数量，其中革兰氏阳性菌能够增加IL-10分泌细胞的数量，革兰氏阴性菌则能够增加IL-12分泌细胞的数量。Hansen等在检测IL-10分泌量不足小鼠的肠道时发现，其肠道菌群的多样性降低在检测患有结肠炎导致肠黏膜免疫受到损伤小鼠的肠道时发现，其肠道放线菌、蛋白菌、大肠杆菌等的数量增加，而产气芽孢梭菌等的数量大量减少。由此可见，肠道菌群通过激活肠黏膜免疫细胞因子与免疫应答这一机制而对肠黏膜免疫发挥着重要调控作用。
肠道菌群能够促进T细胞的活化，提供主要组织相容性复合体（MHC），对活化肠黏膜免疫抗原提呈通路起着关键性的作用。树突状细胞（DCs）是PP圆顶区（SED）产生的目前已知的最强有力的一种抗原提呈细胞（APC），也是肠黏膜免疫中特殊的专职抗原提呈细胞。正常情况下，DCs处于休眠的未成熟状态，具有很强的细胞吞噬能力，能够高表达可捕获抗原的MHC，低表达能与辅助性T细胞（Th）受体结合产生协同作用的协同刺激分子（CM）一旦被外源菌活化，DCs便开始成熟，此时失去吞噬能力，但同时激活抗原加工机制，细胞表面开始呈现能够捕获抗原的MHC，然后在MHC刺激下肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-β（IL-β）和白细胞介素-12（IL-12）等细胞因子开始合成。此后，有益菌群如乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌根据菌量的变化，通过表层蛋白与DCs的结合来调节肠道黏膜免疫功能，其主要机制为有益菌群及其表面复合物与DCs间相互作用产生的两者间浓度比例的高低变化，使抗炎细胞因子表达发生由高到低的变化，促炎细胞因子发生由低到高的反向变化。
综合以上分析表明，非淋巴外周组织中的DCs（iDCs）是引起肠黏膜免疫反应与耐受的基础，其关键机制是：iDCs表面只表达MHC，抑制了能与Th协同作用产生具有活化T细胞第2信号的关键分子CM的表达。但值得注意的是，iDCs被激活后成熟的DCs对外源病原菌的识别仅依赖于一种高度保守的结构基序——病原相关分子模式（PAMPs），包括肠道菌群的脂多糖、肽聚糖、C-型凝集素和甘露糖受体等。
4.3激活肠黏膜免疫细胞因子与免疫应答
肠道菌群能上调TOLL样受体、IL-10等细胞因子的表达，对免疫细胞因子的调节起重要调控作用。免疫调节的主要机制是免疫系统中的免疫细胞和免疫分子之间以及与其他系统如神经内分泌系统之间的相互作用，使得免疫应答以最恰当的形式维持在最适当的水平。肠道黏膜隐窝处起始部位菌群密度升高时，可以激活隐窝内上皮细胞表面对Toll样受体TLR分子的识别，继而引发固有免疫反应应答，诱导PP细胞分泌抗菌肽，清除过量存在的外源病原菌。Ma等利用含有被极化的T84模型细胞来模拟结肠上皮细胞做体外培养试验，发现致病性沙门氏菌或TNF-α能引发一些非致病性沙门氏菌和罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuter）减弱肠黏膜细胞对白细胞介素-8（IL-8）的分泌作用。Dogi等研究发现，一些菌株能显著增加IgA+B细胞的数量，其中革兰氏阳性菌能够增加IL-10分泌细胞的数量，革兰氏阴性菌则能够增加IL-12分泌细胞的数量。Hansen等在检测IL-10分泌量不足小鼠的肠道时发现，其肠道菌群的多样性降低在检测患有结肠炎导致肠黏膜免疫受到损伤小鼠的肠道时发现，其肠道放线菌、蛋白菌、大肠杆菌等的数量增加，而产气芽孢梭菌等的数量大量减少。由此可见，肠道菌群通过激活肠黏膜免疫细胞因子与免疫应答这一机制而对肠黏膜免疫发挥着重要调控作用。
5、小结
近年来，肠道菌群在调控肠道黏膜屏障与免疫功能中发挥的重要作用及其机制正日益受到研究者的高度重视。目前，国内外学者对肠道菌群与肠黏膜免疫互作调控机制的研究越来越深入，许多问题得到理论和实践支持。肠道菌群在肠道黏膜中的协同作用是极其复杂的，因此，利用现代营养与免疫学、分子生物学等研究手段，对肠道菌群的代谢利用途径、免疫调控机制和基因的表达机制等做深入的研究，将是未来的重点发展方向。
参考资料：Acheson D W K. Microbial-gut interactions in health and disease. Mucosal immune responses[J]. Baillière' s Best Practice and Research in Clinical Gastroenterology, 2004,18(2):387-404.
参考资料：Acheson D W K. Microbial-gut interactions in health and disease. Mucosal immune responses[J]. Baillière' s Best Practice and Research in Clinical Gastroenterology, 2004,18(2):387-404.
